Рисунок 1. Приклад діаграми Яблоньського та спектри поглинання / випромінювання флуоресценції типової флуоресцентної молекули.
Структура внутрішньодіапазонного коливання та енергетичний диференціал між S0 та S1 сильно залежать від структури молекулярних зв'язків, особливо від наявності подвійних та потрійних зв’язків, які експлуатують зв'язані р-електрони. В результаті складні органічні та біологічні молекули мають тенденцію проявляти високу автофлуоресценцію. Ця відповідь є причиною того, що науки про життя були одними з найбільш ранніх адаптерів флуоресцентної спектроскопії і дозволяють сконструювати великі органічні молекули, відомі як флюорофори зі специфічними властивостями поглинання та випромінювання, що підходять для конкретних застосувань. Крім того, ці флюорофори можуть бути розроблені для зв'язування з конкретними молекулами, що цікавлять, створюючи хімічно чутливі мітки флуоресценції, такі як зазначені раніше для секвенування ДНК. В останні роки квантові точки також стали популярними у флуоресцентних програмах, в цьому випадку спектри випромінювання не пов'язані стільки з молекулярною структурою матеріалу, а натомість залежать від розміру самої квантової точки. Оскільки вартість і складність технології нанофабрикації знизилися за останнє десятиліття, квантові точки все частіше використовуються для широкого спектру флуоресцентних застосувань, включаючи анти-підробку.
Типові конфігурації вимірювання
Оскільки флуоресцентна спектроскопія може використовуватися в такому широкому спектрі застосувань, інструментальні конфігурації також сильно різняться від застосування до застосування. З цієї причини більшість дослідників вважають за краще використовувати налаштовані компоненти, які можна легко замінювати та виключати залежно від потреб конкретної програми. Компанія Avantes тісно співпрацювала з багатьма дослідниками та інженерами технологічних процесів для полегшення вимірювань флуоресценції в лабораторних, клінічних та промислових середовищах, використовуючи мініатюрні спектрометри, джерела світла та аксесуари, пов'язані з волокнами. Протягом цього періоду ми розробили повний набір конфігурацій спектроскопії флуоресценції, який дослідники змогли використовувати як у лабораторних, так і в трансляційних дослідженнях. Багато з цих конфігурацій також послужили основою для широкого спектру комерційних продуктів, які використовують спектрометри Авантеса OEM як свій вимірювальний інструмент.
Через відносно низькі енергетичні рівні, пов'язані з флуоресцентною спектроскопією, порівняно з іншими методами, такими як УФ / Віс спектроскопія, переважно вибирати спектрометр високої чутливості, такий як AvaSpec-Hero або AvaSpec-HS2048XL-EVO. Спектрометри з підвищеною чутливістю, такі як ці, особливо корисні для таких вимогливих застосувань, як вимірювання автофлуоресценції в тканинах або виявлення фторофорів низької концентрації в матриці зразка. На щастя, однак, порівняно з іншими спектроскопіями з низьким світлом, такими як Раманова спектроскопія та дифузна рефлекторна спектроскопія, флуоресценція має перевагу порівняно широких діапазонів випромінювання, що дозволяє спектроскопістам, що працюють з більш сильними флуоресцентними зразками, альтернативно розглянути менш чутливий спектрометр, такий як AvaSpec-ULS2048CL-EVO або AvaSpec-Mini2048CL з широкою вхідною щілиною для отримання більше світла в спектрометр. Майже всі спектрометри Avantes оснащені можливістю змінних вхідних прорізів, що дозволяють користувачеві експериментально визначити оптимальну ширину вхідних щілин для кожного конкретного застосування флуоресценції, додатково підвищуючи гнучкість, що надається мініатюрними спектрометрами, сполученими з волокнами.
Виміри на основі кювети
Найпростіша з усіх апаратів флуоресцентної спектроскопії використовує волоконну кювету, сполучену з волокном, з ортогональними відсіками для збору спектрів з зразка в розчині у стандартній кюветі на 10 мл. Такий підхід можливий, оскільки більшість розчинників з невеликими молекулами, такі як вода, спирт та циклогексан, практично не мають сигналу автофлуоресценції, що дозволяє зразку та фторофору розчинятись у розчині для легкої обробки.
Незважаючи на типові вимірювання ультрафіолетового випромінювання, у конфігурації вимірювання флуоресценції порт збудження та порт збирання повинні бути ортогональними (під кутами 90 градусів) один до одного, як показано на малюнку 2, щоб запобігти пропусканню світла від джерело збудження від перенапруження флуоресцентного одиничного. Використовуючи цю конфігурацію вимірювання флуоресценції, порт відповідно до джерела збудження може бути залишений відкритим, щоб запобігти відбиттю промінь світла всередині держателя кювети. Він також може бути закритий дзеркалом для створення осередку з подвійним проходом або підключений до другого спектрометра для одночасного вимірювання спектра поглинання УФ / Віс. Подвійна ультрафіолетова та флуоресцентна здатність цього простого компонента є особливо корисною для контролю якості під час виготовлення флуоресцентних барвників та квантових точок, оскільки дозволяє одночасно визначати властивості збудження та випромінювання молекули.
Малюнок 2. Власник кюветної клітини CUV-UV / VIS-TC з контрольованою температурою від Avantes.
Крім того, термоелектричний контролер кювети, такий як CUV-UV / VIS-TC, показаний на малюнку 2, дозволяє оператору точно контролювати температуру зразка між -30 ° C і + 105 ° C з точністю 0,05 ° C. Цей тип тримача кювети забезпечує не тільки можливість стабілізації температури зразка під час вимірювання, але й дозволяє змінювати температуру зразка в режимі реального часу, дозволяючи кількісно визначити температурний вплив на спектри викидів.
Вимірювання на основі зонда
Хоча кювети добре працюють для багатьох застосувань, не завжди бажано видаляти зразок для цілей тестування. Під час випробування зразків рідких чи порошків одна з альтернатив полягає у використанні волоконно-оптичного зонду флуоресценції, подібного до показаного на малюнку 3. Ці зонди використовують роздвоєну конструкцію, що дозволяє джерело збудження з'єднуватися з однією ніжкою, а спектрометр - з іншою. Хоча ці зонди можуть використовувати безліч різних конфігурацій внутрішніх волокон, наприклад, дванадцять 200-мікронних волокон, що оточують одне 600-мікронне волокно, як показано на малюнку 3, всі вони мають одне спільне, а це шляхи збудження та збирання на вибірки є обома колінеарними. Ця геометрія значно спрощує конструкцію зонда, враховуючи компактний форм-фактор, але це призводить до збільшення збору сигналу збудження порівняно з ортогональним підходом, який використовується держателем кювети.
Малюнок 3. FCR-UV200 / 600-2-IND - флуоресцентний зонд від Avantes.
Щоб пом'якшити проблеми з колекцією, пов'язані з цією конфігурацією системи флуоресценції, необхідно додати додаткові етапи фільтрації по шляху збирання. Avantes пропонує як вбудовані, так і прямі фільтр-тримачі, що дозволяють користувачеві фільтрувати сигнал як на шляху збудження, так і на шляху збирання. Як правило, розміщення смугового фільтра в лінії збудження і тільки пускання світла в смугу збудження в зонд виконають це. Оскільки немає ідеального фільтра, однак, часто доводиться додавати фільтр довгого проходу на збірний шлях для подальшого зменшення надлишкового світла від джерела збудження. На малюнку 4 показаний приклад налаштування, коли тримач фільтра прямого приєднання FH-DA приєднаний до джерела світла збудження, а між вставним волокном фільтра FH-INL вставляється між ніг збирання роздвоєного волокна та накладним шнуром, підключеним до спектрометр.
Малюнок 4. Типова конфігурація зонду флуоресценції.
На додаток до стандартних вимірювань занурення, флуоресцентні зонди також ідеальні для тестування in situ у найрізноманітніших областях, починаючи від біомедичної діагностики до археологічних досліджень. Для кожної з цих застосувань конфігурація волокон зонда може дещо відрізнятися від прикладу, показаного на малюнку 2, але загальний принцип залишається колишнім. Одне унікальне застосування флуоресцентних зондів полягає в лікуванні зубів, де джерело ультрафіолетового світла може служити і каталізатором затвердіння, і як джерело збудження для самого вимірювання флуоресценції.
Ще одне цікаве використання цих зондів полягає в аутентифікації мистецтва, де спектри флуоресценції дозволяють зрозуміти пігменти, які використовуються при виробництві картини, дозволяючи дослідникам визначити, чи відповідає фарба періоду, коли цей витвір мистецтва нібито був виготовлений. Хоча, надмірне опромінення ультрафіолетом також може пошкодити самі пігменти, тому забезпечення цілісності роботи вимагає додаткового догляду.
Флуоресцентна мікроскопія
Флуоресцентна мікроскопія датується початком 20 століття, що збігається з винаходом ультрафіолетового мікроскопа в 1911 р. Ранні дослідники в цій галузі швидко зрозуміли, що ультрафіолетове збудження, яке було спочатку обрано в спробі збільшення просторової роздільної здатності зображень, викликає автофлюоресценцію у своїх зразках, і до 1914 р. вони продемонстрували, що флуорофори можуть бути створені для зв'язування з живими клітинами, що дозволило вперше визначити молекулярну інформацію на мікроскопічному рівні.
Сьогодні флуоресцентна мікроскопія стала однією з найбільш широко використовуваних методик в біологічних науках, що забезпечує гіперспектральне зображення високої роздільної здатності живих клітин та інших біологічних зразків. Хоча в більшості випадків джерело збудження є одномодовим лазером для забезпечення дифракційного обмеженого зображення, вимоги до спектрометра в іншому випадку практично такі ж, як і в іншій конфігурації, обговореній раніше. Avantes пропонує три стандартних адаптери мікроскопа, які дозволяють користувачеві легко підключити мініатюрний спектрометр до будь-якого стандартного порту мікроскопа через волоконно-оптичний патч-шнур.
Фінальні думки
Avantes пропонує широкий спектр спектрометрів та аксесуарів, що ідеально підходить як для лабораторних, так і для флуоресцентних спектроскопій, включаючи AvaSpec-HS2048XL-EVO, AvaSpec-HSC1024X58-TEC (AvaSpec-Hero) та AvaSpec-ULS2048XL-EVO. Кожен з цих спектрометрів доступний як автономний блок, модуль OEM, або може бути інтегрований у багатоканальну систему кріплення в стійку, яка поєднує джерело збудження та спектрометр (и) в одному корпусі, що робить їх ідеальними для лабораторії, створеної на замовлення систем. Лінія інструментів AvaSpec зв’язується через USB3.0, Ethernet, RS-232 та дозволяє активні цифрові та аналогові можливості введення / виводу, забезпечуючи безліч опцій інтерфейсу з іншими пристроями. Крім того, пакет розробок програмного забезпечення Avantes AvaSpec DLL із зразковими програмами в Labview, MatLab, Delphi, Visual Basic, C #, C ++ та багатьох інших середовищах програмування дозволяє користувачам розробляти власний код для флуоресцентних програм.
Для отримання додаткової інформації про повний спектр параметрів спектрометра, доступних від Avantes для флуоресцентної спектроскопії, зв’яжіться з нами, щоб сьогодні обговорити вашу заявку на спектроскопію зі знаючими фахівцями з додатків.